非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒森康 SK-Q-SV-01

时间：2021/2/27 11:13:58 点击：次

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒森康

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【用法与判定】

1 用法

1.1 样品处理

血液样品直接用；淋巴结、脾脏、扁桃体样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1万单位青霉素和1万单位链霉素）混匀（样品不足2.0 g按1:5比例加PBS），对处理的待检样品置70℃，30 min灭活后，3 000 r/min，4 ℃离心5 min，取上清液，编号备用；血球粉处理同上，只不过省掉研磨步骤。

1.2 样品存放

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

1.3 操作步骤

1.3.1 病毒DNA的提取（使用A盒）

（1）待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌的1.5 mL离心管，逐管编号。

（2）每管加入Buffer A 500 mL。

（3）每管分别加入已处理的待检样品、阳性对照、阴性对照各200 mL，充分混匀，室温放置10分钟。

（4）取与上述离心管等量的DNase-Free吸附柱和收集管，编号。将离心管中的溶液转移至DNase-Free吸附柱，（为避免堵塞吸附柱，尽量不要吸悬浮杂质）。

（5）13000 r/min室温离心30 sec。

（6）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。

（7）吸附柱内加入600 μL Buffer B，13000 r/min离心30 sec。

（8）弃去收集管液体，将吸附柱放回收集管中。

（9）重复步骤（7），（8）。

（10）13000 r/min空柱离心2 min，去除残留液。

（11）将每个吸附柱分别移入新的1.5mL离心管中，向柱中央加入50 μL Buffer C，室温静置1 min，13000 r/min离心30 sec，离心管中液体即为模板DNA。获得的DNA溶液，冰上保存备用（注意提取的DNA须在2 h内进行PCR 扩增，若需长期保存须

放置-80 ℃冰箱，但应避免反复冻融）。

1.3.2 荧光PCR扩增（使用B盒）

（1）从试剂盒中取出荧光PCR反应液、Taq酶，室温融化后，2 000 r/min离心5 sec。设所需PCR管数为n（n = 样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要20 μL 荧光PCR反应液和0.5 μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装20 μL。

（2）分别向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制备的DNA溶液各5μL，盖紧管盖，500 r/min 离心30 sec。

（3）将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。反应参数设置：

第一阶段，预变性95℃/3 min；第二阶段，95℃/15 sec，52℃/10 sec，60℃/35 sec共45个循环。荧光收集在第二阶段每次循环的60℃延伸时进行。

2 判定

2.1 结果分析条件的设定

阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的较高点为准。对于多通道荧光PCR仪，选定FAM(465-510)检测通道读取检测结果，ABI仪器选择FAM无荧光淬灭基团。

2.2 质控标准

2.2.1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

2.2.2 阳性对照的Ct值应小于等于28，并出现典型的扩增曲线。

2.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。

2.3 结果判定

2.3.1 阴性：无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。